To μοριακό σύμπλοκο ενδιάμεσων & συντόμων παλίνδρομων επαναλήψεων (CRISPR/Cas9), αποτελεί ένα μοναδικό βιολογικό εργαλείο στη γενετική τροποποίηση και χρησιμοποιείται ευρέως στη λειτουργική γονιδιωματική, μεταγραφομική, πρωτεομική έρευνα και στη βιοτεχνολογία. Σκοπός της χρήσης του CRISPR/Cas9 είναι η τροποποίηση σημαντικών σημείων του γονιδιώματος για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών οδών που αφορούν ανίατα μέχρις σήμερα νοσήματα (ανοσολογικά, βαριά νοσήματα, ιογενείς λοιμώξεις & ανοσοανεπάρκειες, καρκίνος, μονογονιδιακές μεταλλάξεις κτλ.).

Πλεονεκτήματα του CRISPR/Cas9 έναντι των υπολοίπων νουκλεάσεων

Τα πλεονεκτήματα της Cas9 έναντι των υπόλοιπων νουκλεασών – πρωτάασων TALEN & ZINF, είναι ότι το  CRISPR/Cas9 αναγνωρίζει RNA/DNA μόρια και έχει την ιδιότητα εφαρμογής πολλαπλών συνδέσεων με τη νουκλεοτιδική αλληλουχία. Επιπλέον, δεν απαιτείται μεγάλη ειδικότητα πρόσδεσης από παρουσία ειδικών μορίων εκκινητών (primers), με κατεύθυνση 5΄>3΄. Το συνένζυμο Cas9 έχει την ιδιότητα της ενδονουκλεάσης, η πρόσδεση του στη δίκλωνη αλυσίδα DNA για τμηματισμό νουκλεοτιδικών αλληλουχιών είναι σχετικά ευκολότερη έναντι των άλλων μορίων και ταχύτερη. Η σύναψη του CRISPR/Cas9 στο DNA κατευθύνεται μέσω ειδικών αλληλουχιών PAMs για να προστεθεί στην αλληλουχία στόχος (Liu et al., 2023).

Ανακάλυψη

Μελέτες δείχνουν την ανακάλυψη του CRISPR-Cas9 να εντοπίστηκε πρώτα στο βακτήριο Escherichia coli το 1987, ύστερα από μελέτη γονιδιακής αλληλούχισης από την ομάδα του Ishino στο Πανεπιστήμιο της Οσάκα Ιαπωνίας (Ishino et al., 1987). Χρειάστηκαν αρκετά χρόνια για να κατανοηθεί η λειτουργία του γενετικού τροποποιητή. Η πλήρης αλληλούχιση και μελέτη δομής του CRISPR πραγματοποιήθηκε στο Πανεπιστήμιο Αλικάντε της Ισπανίας το 1995, όπου η ίδια δομή βρέθηκε στο αρχαιοβακτήριο Haloferax mediterranei. Παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ότι και τα δύο βακτηριακά είδη κατείχαν κοινές δομικές αλληλουχίες (25-50bps), στα οποία περιείχαν γενετικές πληροφορίες ενίσχυσης βακτηριακής ανθεκτικότητας και προσαρμογής στο περιβάλλον. Κατά αυτό τον τρόπο η μελέτη έγινε σε περισσότερα βακτηριακά είδη και έτσι εκδόθηκε η πρώτη κατανόηση για τη γονιδιακή τροποποίηση (Mojica, Juez and Rodriguez-Valera, 1993). 

Τρόπος λειτουργίας και εύρεσης θέσεων πρόσδεσης στο γονιδίωμα

Το σύμπλοκο CRISPR-Cas9 όπως λέει και το όνομα του ενζύμου αποτελείται από δύο ενεργές υπομονάδες την CRISPR και Cas9, η κάθε επιμέρους υπομονάδα προσφέρει διαφορετικές φυσικοχημικές δραστηριότητες. Πρώτα, η υπομονάδα CRISPR φέρει αλληλουχία ξένου DNA παράγοντας έτσι μεμονομένο δικό του RNA (crRNA), το οποίο οδηγεί στην αλληλουχία στόχος του γονιδίου παίζοντας ρόλο στην ενσωμάτωση ή αφαίρεση ξένης γενετικής πληροφορίας στο κύτταρο ξενιστή. Ενώ η μονάδα Cas9 ενσωματώνει το γενετικό υλικό στο DNA του ξενιστή οδηγούμενη από το crRNA κατευθυντήριο (Liu et al., 2023).

Η Cas9 υπομονάδα δραστηριοποιείται και ως ενδονουκλεάση με κυρίαρχο ρόλο τη διάσπαση αλληλουχίας DNA και την επανένωση της. Η πρόσδεση του CRISPR-Cas9 στο DNA μπορεί να γίνει μεμονωμένα ή σε πολλαπλά σημεία μαζί. Αναλυτικότερα, το cas9 κατευθύνεται από κατευθυντήριο RNA (gRNA) μήκους 20 νουκλεοτιδίων περιλαμβάνοντας το crRNA (γενετική πληροφορία) που περιλαμβάνει ειδικές βάσεις στόχευσης στο DNA. Συχνά η παρουσία gRNA & crRNA αναφέρεται ως sgRNA. 

Η πρόσδεση επιτυγχάνεται με την αναγνώριση του sgRNA της Cas9 σε ειδικές περιοχές στόχους DNA του ξενιστή. Συχνότερα οι περιοχές στόχευσης (loci) αποτελούν ειδικά γονίδια, ή εισαγωγή παλίνδρομων αλληλουχιών. Η αναγνώριση γίνεται στο 5΄ άκρο της έλικας ενώ η Cas9 θα προσδεθεί στο 3΄ αρχίζοντας την γενετική τροποποίηση (Huang et al., 2022).

Εικόνα (Huang et al., 2022).

Οι σημαντικότερες ιδιότητες του CRISPR-Cas9 ως γενετικός τροποποιητής είναι:

1. Έχει τη δυνατότητα να προσθέσει ή να αφαιρέσει μία ή περισσότερες νουκλεοτιδικές βάσεις στο DNA.
2. Τη τροποποίηση συγκεκριμένων επίτοπων πάνω στο γονιδίωμα, για παράδειγμα τη μετατροπή βάσεων από κυτοσίνη σε θυμίνη (C>T) ή από αδενίνη σε γουανίνη (A>G).
3. Την μετατροπή περισσότερων βάσεων μέσα στο γονιδίωμα (προσθήκες, διαγραφές, μετατροπές).
4. Την επιρροή στην γονιδιακή έκφραση του κυττάρου με επιγενετική σίγαση ή ενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδιακών περιοχών (Huang et al., 2022).

Οι ιδιότητες που προσφέρει το συνένζυμο CRISPR-Cas9 έφεραν επανάσταση στη κατανόηση εξέλιξης και επιβίωσης των μικροοργανισμών, αλλά και στο τομέα της βιοτεχνολογίας. Η κατανόηση της λειτουργίας του συμπλόκου CRISPR-Cas9 ανέδειξε καινοτόμες επιλογές ώστε να χρησιμοποιηθεί αυτό το φυσικό βιολογικό εργαλείο για θεραπευτικούς σκοπούς.

Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ακριβείας CRISPR-Cas9 μας επιτρέπει την επεξεργασία του γονιδιώματος σε κύτταρα και ιστούς ενδιαφέροντος. Η επέμβαση σε κύτταρα, ιστούς και όργανα μέσω της γενετικής τροποποίησης θα μπορούσε να επαναφέρει την αναγέννηση των ιστών, την επιδιόρθωση σχετικών βλαβών και την καταστροφή καρκινικών κυττάρων που θα μπορούσε να σώσει εκατομμύρια ζωές ασθενών.

Εφαρμογές του CRISPR-Cas9 στη σύγχρονη ιατρική

Τα τελευταία χρόνια ολοένα και περισσότερα πειράματα αναπτύσσονται σε δοκιμές in vivo & in vitro ανάλογα του τύπου κυττάρων και ιστού που στοχοποιούνται για την εφαρμογή του CRISPR-Cas9 σε ανοσολογικά, γενετικά, καρδιαγγειακά, νευρολογικά νοσήματα, καθώς και σε καρκίνο. Αν και οι γενετικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται μέσω CRISPR-Cas9 είναι ελάχιστες. Οι επιστήμονες αναζητούν διαρκώς νέους τρόπους εισχώρησης του CRISPR-Cas9 στα κύτταρα στόχος.  

1. Μέσω ιικού φορέα (viral vector) από αδενοϊο και φακοϊών μορφών. Οι ιικοί φορείς περιέχουν το σύμπλοκο cas9 σε μορφή RNA. Ωστόσο είναι επιλεκτική η τοποθέτηση τους λόγω της διαφορετικής αναπτόκρισης κάθε ιστού.
2. Εισαγωγή μέσω πλασμιδιακού DNA, εισάγεται το CRISPR-Cas9 μέσω μορφής DNA στα κύτταρα στόχος και απορροφάται μέσω ηλεκτροπόρωσης στο κύτταρο. 
3. Μέσω χορήγησης βινονουκλεοπρωτεϊνης RNP με οδηγό RNA μόριο. Δεν ενσωματώνεται στο γονιδίωμα το cas9 και παρέχει μεγάλη αποτελεσματικότητα. Σε μερικούς τύπους κυττάρων δεν είναι αποτελεσματικό.
4. Μέσω λιπιδίων LNPs. 
5. Μέσω ενδοκυτταροπλασματικής έγχυσης, είναι αποτελεσματική ένα κύτταρο στόχος. Συγκεκριμένα τα συστατικά του συμπλόκου μεταφέρονται στο γονιμοποιημένο έμβρυο μέσω τεχνικής μικροέγχυσης. (Ankit Kumar Dubey and Mostafavi, 2023).

Πιστεύετε στο άμεσο μέλλον ότι θα αρχίζει η ευρεία χρήση θεραπειών μέσω του CRISPR-Cas9. Παρόλα αυτά, κλινικές δοκιμές δραστηριοποιούνται πάνω στη γονιδιακή θεραπεία σε διάφορες νόσους. Για τη διεξαγωγή και έγκριση μιας τέτοιας θεραπείας θα πρέπει να είναι γνωστά α) η νόσος του ασθενούς, β) οι γενετικές μεταλλάξεις ή φυσική παρέκκλιση, γ) το καταλληλότερο θεραπευτικό σχήμα που θα ακολουθήσει. Είναι φυσικό ότι για τη χρήση της γονιδιακής θεραπείας θα πρέπει να ελαχιστοποιηθούν οι ανεπιθύμητες παρενέργειες, να υπάρχει μηδενικό σφάλμα στη γενετική τροποποίηση, να είναι απορροφητικό το φάρμακο στον οργανισμό και να είναι προσιτό οικονομικά.

Ενδεικτικές γονιδιακές θεραπευτικές δοκιμές είναι:

Νευρολογικά νοσήματα

Νόσος Alzheimer, NHEJ- Bace1 

Νόσος Huntington NHEJ- mHTT

Καρδιομυοπάθεια NHEJ – Ryr2 & 

Ανοσοποιητικό σύστημα NHEJ- Ntn1, Tnfrsf13c & CD40.

Καρκίνος Plk1, MTH1, Lcn-2, STAT3, RUNX1. (Huang et al., 2022)

Η χρήση του συμπλόκου CRISPR-Cas9 άλλαξε τα όρια της βιολογίας και γενετικής επιστήμης. Οι δυνατότητες που προσφέρει αυτό το μόριο στη γενετική εφαρμογή είναι τεράστιες πέραν των συμβατικών εργαλείων που ήταν γνωστά μέχρι την ανακάλυψη του. Οι πειραματικές δοκιμές συνεχίζονται για εύρεση νέων θεραπευτικών σχημάτων όπως κατά του HIV1 που θα εξασφαλίσει την πλήρες αποβολή του ιικού σωματίου από τα κύτταρα.

Άρθρο της HumanGenomics
Μιχαήλ Σεβνταλής
Βιοεπιστήμονας Γενετικής & Σύμβουλος Γενετικής

Αναφορές

• Ankit Kumar Dubey and Mostafavi, E. (2023). Biomaterials-mediated CRISPR/Cas9 delivery: recent challenges and opportunities in gene therapy. Frontiers in Chemistry, 11. doi:https://doi.org/10.3389/fchem.2023.1259435.
• Huang, K., Zapata, D., Tang, Y., Teng, Y. and Li, Y. (2022). In vivo delivery of CRISPR-Cas9 genome editing components for therapeutic applications. Biomaterials, 291, p.121876. doi:https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121876.
• Liu, Z., Shi, M., Ren, Y., Xu, H., Weng, S., Ning, W., Ge, X., Liu, L., Guo, C., Duo, M., Li, L., Li, J. and Han, X. (2023). Recent advances and applications of CRISPR-Cas9 in cancer immunotherapy. Molecular Cancer, 22(1). doi:https://doi.org/10.1186/s12943-023-01738-6.
• Mojica, F.J.M., Juez, G. and Rodriguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular Microbiology, [online] 9(3), pp.613–621. doi:https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1993.tb01721.x.
• Tyumentseva, M., Tyumentsev, A. and Akimkin, V. (2023). CRISPR/Cas9 Landscape: Current State and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences, [online] 24(22), p.16077. doi:https://doi.org/10.3390/ijms242216077.
• Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M. and Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12), pp.5429–33. doi:https://doi.org/10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987.