Εισαγωγή

Το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτέλεσε κατά καιρούς ιδιαίτερη πρόκληση στην επιστήμη της γενετικής. Η πολυπλοκότητα του γονιδιώματος ανέρχεται αρχικώς στην αχανή του έκταση και στα χιλιάδες γονίδια που περιέχει. Αξίζει να σημειωθεί, ότι τον προηγούμενο αιώνα οι τεχνολογίες γονοτύπησης βρίσκονταν στα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης τους και δεν υπήρχε η δυνατότητα αλληλούχισης.

Μέχρι την δεκαετία του 1980 οι τεχνικές γενετικής βασίζονταν περισσότερο στο μοριακό καρυότυπο, μια μέθοδος συμβατή και αποδοτική που χρησιμοποιείται μέχρι σήμερα στα εργαστήρια για την ανάλυση της γενετικής σύστασης της χρωματίνης. Το πλεονέκτημα του καρυότυπου ήταν ότι επέτρεψε τη μελέτη μεγάλων μορίων των χρωμοσωμάτων και την ανάλυση της πυκνότητας, δομής και αριθμητικής ακεραιότητας του DNA. Ωστόσο, βαθύτερη ανάλυση πέραν της οπτικοποίησης των χρωμοσωμάτων δεν επιτρεπόταν να γίνει. Για την εποχή η μοριακή εξέταση σε επίπεδο αλληλουχίας μπορούσε να επιτευχθεί τοπικά και μόνο από τεχνικές PCR με μεγάλο περιορισμό για την εποχή εκείνη.

Εικόνα μοριακού καρυότυπου ανδρός με 23 XY ζεύγη χρωμοσωμάτων.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Καθώς τα χρόνια προχωρούσαν το 1985 με τη συνεισφορά του Kary Banks Mullis η μοριακή βιολογία ανέπτυξε νεότερες μεθόδους γονοτύπησης με την εφαρμοσμένη τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (polymerase chain reaction) γνωστή ως PCR. Η τεχνική της PCR βασίζεται στην αποδιάταξη των κλώνων του DNA με τη βοήθεια θερμότητας και την τοποθέτηση ειδικών εκκινητών που αναγνωρίζουν την αλληλουχία στόχου (εκμαγείο) με ειδικό ένζυμο πολυμεράσης και μιμείται την φυσιολογική αντιγραφή για το σχηματισμό συμπληρωματικού DNA . Η διαδικασία της πολυμεράσης είναι επαναλαμβανόμενη όσο διαρκεί ο κύκλος της αντίδρασης. Έτσι, μετά από μερικούς κύκλους αντίδρασης επιτυγχάνεται η συσσώρευση εκατομμυρίων αντιγράφων θραυσμάτων του DNA ενδιαφέροντος. Η οπτικοποίηση των θραυσμάτων DNA είναι δυνατή μέσω ηλεκτροφόρησης με τη βοήθεια χρωστικής.

Η εικόνα αναπαριστά τη διαδικασία ενός κλασσικού κύκλου PCR. Αρχικά το DNA θα αποδιαταχθεί με τη χρήση θερμότητας  και στο κάθε κλώνο θα ενωθούν οι αντίστοιχοι εκκηνιτές με σκοπό την αναγνώριση του σημείου αντιγραφής. Στη συνέχεια η DNA πολυμεράση με κατεύθυνση 5 – 3 συνθέτει τη συμπληρωματική αλληλουχία και η διαδικασία είναι επαναλαμβανόμενη μέχρι την λήξη της αντίδρασης.

Αλληλούχιση πρώτης γενιάς κατά Sanger

Η τεχνική της PCR αποτέλεσε τον προάγγελο για την ανάπτυξη καινοτόμων τεχνικών βασιζόμενες στη PCR φέρνοντας την νέα εποχή αλληλούχισης. Η πρώτη μέθοδος αλληλούχισης πραγματοποιήθηκε από τον Frederick Sanger το 1977 και αναπτύχθηκε σε οπτική αλληλούχιση με χρωματογράφημα το 1987. Η τεχνική περιλαμβάνει τα βασικά βήματα της PCR, αλλά μπορεί να αποδώσει εικονική αλληλούχιση σε τμήματα 100 ~ 1000bps.

Η μέθοδος της τεχνικής είναι παρόμοια με την PCR. Στο μείγμα αντίδρασης περιέχονται τα ίδια βιομόρια δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) που απαρτίζουν τα στοιχεία για την δημιουργία αντιγράφων θραυσμάτων DNA (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) και τα διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs) που αποτελούν νουκλεοτίδια με ειδική φθορίζουσα ουσία (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) τα οποία αποδίδουν σήμανση της αλληλουχίας. Το σημαντικό μέρος της μεθόδου είναι μόλις αρχίζει το θραύσμα και αντιγράφεται ένα φθορίζον νουκλεοτίδιο θα σταματήσει την σύνθεση της DNA πολυμεράσης και θα προσδώσει χρώμα. Με αποτέλεσμα, χιλιάδες σήματα συσσωρεύονται και σχηματίζουν την αλληλουχία στόχος. Κατά αυτό τον τρόπο έγινε τμηματικά η αλληλούχιση του πρώτου ανθρώπινου γονιδιώματος.

Τεχνική κατά Sanger αλληλουχεί μικρά θραύσματα DNA, η πορεία της αλληλούχισης γίνεται με την τοποθέτηση ειδικών ddNTPs οπτικοποιώντας την αλληλουχία DNA.

Human Genome Project και αλληλούχιση επόμενης γενιάς

Η αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος ξεκίνησε με την υλοποίηση του Human Genome Project (HGP) το 1990 και ολοκληρώθηκε το 2003. Περισσότερα από 20 ερευνητικά εργαστήρια σε ολόκληρο το κόσμο και χιλιάδες επιστήμονες εργάστηκαν για την αλληλούχιση του πρώτου ανθρώπινου γονιδιώματος. Η έρευνα διήρκησε 13 έτη και κόστισε περισσότερο από 2.1 δισεκατομμύρια δολάρια. Η δημοσίευση του ανθρώπινου γονιδιώματος έγινε τον Απρίλιο του 2003 με 99% ακρίβεια.

Το ανθρώπινο DNA αποτελείται 3 δισεκατομμύρια νουκλεοτιδικές βάσεις (bps) και περιλαμβάνει ~19.000 ενεργά γονίδια που προσδίδουν λειτουργική πρωτεΐνη. Τα ενεργά γονίδια αποτελούν μόνο το 2% του συνολικού γονιδιώματος. Αυτή η γνώση αποτελεί αντικείμενο έρευνας για τη μελέτη του υπολοίπου DNA που αναλογεί 98%, παρόλα αυτά πραγματοποιήθηκαν μελέτες και φυλογενετικά δέντρα για τη συσχέτιση της εξελικτικής πορείας μεταξύ των ειδών. Η μελέτη του ανθρώπινου γονιδιώματος επέτρεψε την ανάπτυξη νέων επιστημονικών πεδίων στο χώρο της βιολογίας και μοριακής διαγνωστικής. Δηλαδή, η μελέτη της δομής της χρωματίνης για το τρόπο συμπεριφοράς σε σχέση με την ανάπτυξη νέων φαρμάκων (φαρμακογενωμική) τη συμπεριφορά και ρόλο των πρωτεϊνών (πρωτεομική), την μελέτη μεταγραφων RNA και έκφρασης (μεταγραφομική).

Η πρόοδος της τεχνολογίας επέτρεψε στη γενετική διαγνωστική την ανάπτυξη νέων μεθόδων που θα μπορέσουν να αλληλουχίσουν συστάδες γονιδιωμάτων με αφενός χαμηλότερο κόστος και σε συντομότερο χρονικό διάστημα. Η καινοτομία αυτή ονομάζεται η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing) ή αλλιώς NGS όπως προφέρεται. Η αλληλούχιση δείγματος σε NGS γίνεται σε αναλυτές τους λεγόμενους αλληλουχιτές (sequencers),των οποίων η μέθοδος βασίζεται σε φθορισμό και νανοσωματίδια για την ταχύτερη αλληλούχιση εκατομμυρίων θραυσμάτων DNA. 

Συνήθως στις τεχνικές χρησιμοποιούνται αντιστρεπτές χρωστικές στην αναγνώριση δείγματος κατά την αλληλούχιση, έτσι όταν διαχωρίζονται οι κλώνοι και αντιγράφονται σε ένα συγκεκριμένο βαθμό οι χρωστικές αποδίδουν σήμανση της νουκλεοτιδικής τοποθεσίας. Τέλος όλα αυτά τα χημικά σήματα, συσσωρεύονται στον υπολογιστή και αποδίδουν το μήκος της αλληλουχίας DNA που αναλύθηκε.

Στην εικόνα γίνεται σύντομη ανασκόπηση της βασικότερης μεθόδου NGS. Για τη δημιουργία των θραυσμάτων DNA απαιτούνται ειδικές αλληλουχίες στόχευσης προσαρμογείς (adaptors) που ενώνονται με τους κλώνους του δείγματος και αρχίζουν την σύνθεση του υβριδικού DNA. H διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται εως να ολοκληρωθεί η αλληλούχιση. Τέλος, τα συνολικά μήκη των αλληλουχιών ενώνονται και αποτελούν την συνολική αλληλουχία DNA του δείγματος ενδιαφέροντος. 

Οι προσπάθειες αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος έγιναν ευρύτερες με την υλοποίηση νέων προγραμμάτων όπως το 1000 Genome Project, International HapMap Project, Cancer Genome Atlas κτλ. Αυτές οι βιβλιοθήκες επιτρέπουν την πρόσβαση τους ερευνητές για την άντληση γενετικών δεδομένων και γονιδιωμάτων από διαφορετικές χώρες και πληθυσμούς με σκοπό την μελέτη βιοποικιλότητας του ανθρώπου.

Αναφορές

• Eren, K., Taktakoglu, N. and Pirim, I. (2023). DNA Sequencing Methods: From Past to Present. The Eurasian Journal of Medicine, [online] 54(Supp1), pp.S47–S56. doi:https://doi.org/10.5152/eurasianjmed.2022.22280.
• National Human Genome Research Institute (2012). International HapMap Project. [online] Genome.gov. Available at: https://www.genome.gov/10001688/international-hapmap-projec
• National Human Genome Research Institute (2020). The Human Genome Project. [online] National Human Genome Research Institute. Available at: https://www.genome.gov/human-genome-project.
• Ozkan, E. and Lacerda, M.P. (2023). Genetics, Cytogenetic Testing And Conventional Karyotype. [online] PubMed. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK563293/.

Άρθρο της HumanGenomics
Μιχαήλ Σεβνταλής
Βιοεπιστήμονας Γενετικής & Σύμβουλος Γενετικής