Εισαγωγή

Η υπολογιστική βιολογία είναι ένας από τους πιο σύγχρονους κλάδους στο πεδίο των βιοεπιστημών. Μετρήσεις σε πειραματικά δεδομένα, καταγραφή ενώσεων και κυτταρικών μετρήσεων και εργαστηριακών αποτελεσμάτων, σήμερα καταγράφονται στον υπολογιστή και είναι στατιστικά ερμηνεύσιμα. Η ανάπτυξη των νέων υπολογιστικών μεθόδων επέτρεψε στην επιστήμη της γονιδιωματικής να εμβαθύνει σε βάθος αλληλουχίας εντός των γενετικών περιοχών και να πραγματοποιεί μελέτες για το ρόλο των γενετικών μεταλλάξεων σε διάφορες ασθένειες. 

Τον προηγούμενο αιώνα ήταν η χρυσή τομή στις επιστήμες ζωής, με την ανακάλυψη καινοτόμων μεθόδων στην διάγνωση και αντιμετώπιση παθήσεων. Η εξέλιξη της τεχνολογίας έδωσε μεγάλη ώθηση στις βιοεπιστήμες στην ανακάλυψη σημείων που ερμηνεύουν την ζωή φερ ειπείν η συνεισφορά του διδύμου  Watson & Crick στην ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA και των αζωτούχων βάσεων. Στη σημερινή εποχή οι γνώσεις έχει φτάσει στο μέγιστο βαθμό και υπάρχει η δυνατότητα να μελετώνται τα ευρήματα στη μοριακή τους φύση πρωτεΐνες σε αμινοξέα και πολυπεπτιδικές αλυσίδες και το DNA / RNA στο επίπεδο αλληλουχιών.

Οι καταβολές της γονιδιωματικής επιστήμης προέρχονται από την μοριακή βιολογία και την ιατρική. Κατά ουσία πρόκειται για κλάδος που αφιερώνεται όχι στην ανακάλυψη του DNA, αλλά στη μελέτη του γενετικού υλικό σε επίπεδο αλληλουχιών. Η ανάλυση των σημειακών αλλαγών που συμβαίνουν στο γενετικό κώδικα τις περισσότερες φορές αποδίδονται σε ποικιλομορφία μεταξύ των οργανισμών του ίδιου είδους ιδίως στον άνθρωπο. Το ύψος, χρώμα ματιών και μαλλιών, ανθεκτικότητα, όψη δέρματος και εθνικότητα καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι το DNA του καθενός μας είναι μοναδικό και έχει τη δική του πολυμορφία.

Όλα αυτά δεν θα μπορούσαν πέραν τις οπτικής μορφολογικής παρατήρησης σε επίπεδο αμινοξέων και νουκλεοτιδίων εάν δεν υπήρχε η βιοπληροφορική ανάλυση. Η βιοπληροφορική είναι ο τομέας των φυσικών επιστημών που συνδυάζει βασικές γνώσεις υπολογιστικής σε συνδυασμό με βιολογικές εφαρμογές για τη διεξαγωγή αναλύσεων. Σήμερα από τη βιοπληροφορική, η γονιδιωματική είναι σε θέση να μελετήσει το DNA και να συγκρίνει γονιδιώματα μεταξύ τους για τη εύρεση γενετικών μεταλλάξεων.

Σήμερα με την βιοπληροφορική ανάλυση, αναλύονται τα δεδομένα από αλληλούχιση ολόκληρου ανθρώπινου γονιδιώματος WGS και ολόκληρου του εξώματος WES. 

Βιοπληροφορική Ανάλυση σε ανθρώπινο DNA

Μια γενετική μετάλλαξη για να οριστεί ως παθογόνος θα πρέπει να συναντάται σε ασθενείς με το σχετικό νόσημα. Το χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η παθογόνος μετάλλαξη του γονιδίου CFTR Del_508_Phe που προκαλεί το βαρύ φαινότυπο της κυστικής ίνωσης, μιας γενετικής νόσου που κληρονομείται από τους γονείς στους απογόνους. Το γεγονός που συναρπάζει είναι ότι δεν αξιολογούνται μόνο τα ήδη διαγνωσμένα ευρήματα, αλλά και μεταλλαγές που είναι αγνώστου κλινικής σημασίας.

In silico τεχνικές για το προσδιορισμό άγνωστων μεταλλάξεων

Οι μεταλλάξεις που είναι άγνωστες σημαίνει ότι δεν έχουν ακόμη ταξινομηθεί λόγω της απουσίας ατόμων με σχετιζόμενο φαινότυπο. Η παρουσία τέτοιων μεταλλαγών δύναται να αξιοποιηθούν με υπολογιστικά εργαλεία σε επίπεδο αλληλουχίας μια μέθοδο γνωστή ως in silico. Αναλυτικότερα στις in silico μεθόδους γίνεται η συστιχεία του γονιδίου με την εν λόγω μετάλλαξη και διερευνάται πως διαμορφώνεται η πρωτεΐνη του εκάστοτε γονιδίου. Σε περίπτωση υπερέκφρασης είτε καταστολής της ενεργότητας στη πρωτεΐνη μπορεί να κριθεί υψηλής συσχέτισης στην παθογονικότητα. Σε κάθε περίπτωση κάθε εύρημα αγνώστου κλινικής σημασίας θα πρέπει να διερευνάται το είδος μεταβίβασης του γονιδίου, η κλινική του σημαντικότητα και αν συναντάται σε >1% της μερίδας του πληθυσμού.

Η ανάλυση των δεδομένων αποτελεί μια ειδική πρόκληση ειδικότερα στις μέρες μας, καθώς τα εργαλεία δεν είναι ίδια που χρησιμοποιούνται ούτε και οι μέθοδοι υλοποίησης, με αποτέλεσμα η διαδικασία να διαφέρει από χώρο σε χώρο.

Η σύνδεση μεταξύ της βιοπληροφορικής και του εργαστηρίου

Η βιοπληροφορική συνδέεται άμεσα με το εργαστήριο, καθώς τα δεδομένα που θα αναλυθούν δεν είναι παρά η κωδικοποιημένη αλληλουχία DNA του εξεταζόμενου δείγματος. Αρχικά προβλέπεται η απομόνωση του DNA, υβριδισμός και εργαστηριακή ανάλυση σε μηχάνημα αλληλούχισης επόμενης γενιάς NGS. Το μηχάνημα διαβάζει αποκλειστικά το γενετικό υλικό του δείγματος αποτυπώνοντας τις νουκλεοτιδικές βάσεις με τα γράμματα A, G, C, T δηλαδή Αδενίνη, Γουανίνη, Θυμίνη, Κυτοσίνη. Η αλληλούχιση γίνεται με μεγάλο εύρος για την αποφυγή σφαλμάτων και ενίσχυση πιστότητας έως 99%.

Συνοπτικά η ανάλυση χωρίζεται σε : 

1)Ποιοτικό έλεγχο των δεδομένων αλληλούχισης (Quality Control)

2)Περικοπή και φιλτραρισμα (Adapter Trimming)

3)Μετατροπή του αρχείου σε ευανάγνωστο αρχείο χαρτογράφησης βάσεων (Mapping BAM/SAM)

4)Στοίχιση στο γονιδίωμα με το γονιδίωμα αναφοράς (Sequencing Alignment)

5)Ταξινόμηση μεταλλαγών (Variant Calling) και αναφορά (Report)

Σύνοψη εργαλειογραμμής της ανάλυσης

Αρχικά προβλέπεται η επεξεργασία των raw data από ειδικό σύστημα ελέγχοντας το ποιοτικά. Τα raw data είναι οι ακατέργαστες αλληλουχίες DNA του δείγματος από το μηχάνημα με 4 γράμματα των βάσεων (Α, Τ, G, C). Ο ποιοτικός έλεγχος του δείγματος είναι το πρώτο βήμα που πρέπει να γίνει πριν την ανάλυση για την αποφυγή κολλημάτων. Κατά την συνέχεια της επεξεργασίας εμβαθύνεται ο έλεγχος για την αφαίρεση των παραπροϊόντων της αλληλούχισης, έχοντας έτσι πληροφορίες αποκλειστικά του DNA εξεταζόμενου.

Η συστοίχιση με το γονιδίωμα αναφοράς είναι για να ελεγχθεί εάν το εξεταζόμενο DNA έχει μεταλλάξεις, οποιαδήποτε μεταλλαγή στην σειρά των νουκλεοτιδίων πρέπει να αναφέρεται και να αναλύεται. Σε αυτό το βήμα έχοντας πλέον γνώση των γονιδίων και των μεταλλαγών θα γίνει επιπρόσθετη ανάλυση για την ερμηνεία του γενετικού πορίσματος. Η αξιολόγηση γίνεται βάσει των κριτηρίων ACMG/AMP για το καθορισμό της παθογόνου/μη παθογόνου μεταλλαγής.

Αποτέλεσμα και συμβουλευτική

Το τελικό αποτέλεσμα ονομάζεται αναφορά (report) είναι μια έκθεση που αναφέρει τα γενετικά ευρήματα του αναλυμένου γονιδιώματος. Πρέπει να είναι σωστά δομημένο και όσο πιο προσιτό γίνεται ώστε και ο επιστήμονας υγείας να μπορέσει να εξηγήσει το αποτέλεσμα και ο εξεταζόμενος να κατανοήσει την γενετική πληροφορία.

Άρθρο της HumanGenomics
Μιχαήλ Σεβνταλής
Βιοεπιστήμονας Γενετικής/Βιοπληροφορικής & Σύμβουλος Γενετικής